Secuenciamiento y construcción de novo, de un anticuerpo único para el reconocimiento en células de conformaciones alternativas del citocromo c
Resumen
En este trabajo se generó una herramienta clave para el estudio del citocromo c (cyt c), cuya función más reconocida es la transferencia de electrones desde la ubiquinona a la citocromo c oxidasa en la cadena de transporte de electrones mitocondrial. El cyt c se encuentra localizado en el espacio intermembrana mitocondrial, pero puede migrar al citosol celular en donde activa a el apoptosoma induciendo la muerte celular programada por apoptosis. En los últimos años se ha localizado al cyt c en en el núcleo celular y a nivel extracelular. Las funciones en estas nuevas localizaciones, así como la conformación del cyt c (nativa o alternativa), son aún desconocidas.
El cyt c puede sufrir cambios conformacionales reversibles o irreversibles en condiciones fisiológicas como la fosforilación, acetilación, nitración y sulfoxidación. Muchas de estas modificaciones llevan a que el cyt c adopte una conformación alternativa que involucra la pérdida de coordinación del enlace Fe-SMet80 y la ganancia de actividad peroxidasa. La detección de estas conformaciones alternativas a nivel celular y en tejidos es desafiante.
En 1999 el grupo del Dr. Jemmerson en la Universidad de Minnesota obtuvo un anticuerpo (mAb 1D3) que reconocía cyt c de conformación alcalina, pero no en conformación nativa. En el mismo trabajo, identificaron un aumento en la señal utilizando el anticuerpo en células apoptóticas. En un trabajo del grupo publicado en PNAs en el año 2010, se identificó la presencia de cyt c no nativo en la periferia nuclear en células HeLa tratadas con concentraciones subletales de peroxinitrito. La identificación fue mediante el uso del mAb 1D3, como anticuerpo primario mediante ensayos de inmunofluorescencia.
El hibridoma que generaba el mAb 1D3 se perdió debido a problemas en la refrigeración, y como grupo decidimos no volver a publicar hasta que estuviera nuevamente disponible mAb 1D3 para toda la comunidad científica. Por este motivo, nos propusimos resucitarlo en forma recombinante. Para ello, primero obtuvimos las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y liviana mediante mapeo de péptidos por espectrometría de masas y posterior análisis bioinformático. Los plásmidos conteniendo las secuencias de las cadenas livianas y pesadas se transfectaron a células eucariotas para su producción. El anticuerpo recombinante obtenido (R1D3) se comporta de manera similar al mAb original en los ensayos de unión a antígeno. Tanto el R1D3 como el mAb 1D3 reconocen a varias especies de cyt c modificadas oxidativamente (ej: nitradas en Tyr74 u oxidadas en Met80). Los ensayos de competencia con péptidos junto con los estudios de dinámica molecular respaldan que el R1D3 se une a un neoepítope dentro del bucle 40-57. Mediante estudios de inmunofluorescencia e inmunoafinidad utilizando al R1D3, se logró identificar conformaciones alternativas de cyt c en células que fueron tratadas con diferentes oxidantes, así como también, en células senescentes. Realizamos ensayos de pinocitosis celular utilizando cyt c sulfoxidado y confirmamos que esta forma modificada oxidativamente se transloca al núcleo sin activar al apoptosoma. Estudios futuros serán diseñados para evaluar el rol de estos cyt c de conformación alternativa como posibles señalizadores redox a nivel nuclear. Los resultados obtenidos en el presente trabajo abren nuevas interrogantes con respecto a la presencia y posibles funciones biológicas de las conformaciones alternativas del cyt c en células y tejidos.
Este trabajo es un punto de inflexión en la historia de una proteína y la finalización de una construcción colectiva liderada por el Dr. Rafael Radi. El proyecto tuvo financiación del Fondo Clemente Estable (ANII) y de PEDECIBA. La autora principal contó con una beca para docentes, de la Comisión Académica de Posgrado; y varios de los investigadores involucrados cuentan con Dedicación Total de la Universidad de la República. Es en esta órbita que la ciencia avanza, estudiantes de posgrado que pueden dedicarse a los proyectos en los que participan, investigadores consolidados, y proyectos con financiación sostenida en el tiempo. La Red CEINBIO fue clave en el trabajo, ya que permitió el intercambio diario entre pares tanto a nivel nacional como internacional.
