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Nitracion de proteínas in vitro e in cellula utilizando 5-metil-1,4-dinitroimidazol (DNI) como agente nitrante mediada por luz: síntesis y caracterización bioquímica

Resumen

El agente nitrante fotoquímico 5-metil-1,4-dinitro-1H-imidazol (DNI) se ha descrito recientemente como una herramienta eficaz para nitrar residuos de tirosina en proteínas bajo irradiación de 390 nm (Long T. et al., 2021). En este trabajo, describimos la síntesis en un solo paso de DNI a partir del precursor 4-metil-5-nitro-1H-imidazol con buen rendimiento (66%) y alta pureza (>99%). El análisis espectral de DNI revela dos picos máximos (228 y 290 nm) con rendimientos y cinética de nitración máxima a 290 nm. Análisis mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR) y espectrometría de masas (MS) evidenció la formación de dióxido de nitrógeno (•NO2) tras la irradiación de DNI, lo que implica la homólisis del enlace N-N en la molécula de DNI. La irradiación de DNI a 290, 390 nm o luz UVA (315-400 nm) produjo nitración de tirosina, con rendimientos cercanos a ca. 30% bajo irradiación a 290 nm. Posteriormente, utilizando alfa-sinucleína como proteína modelo, la principal modificación postraduccional de la proteína desencadenada por DNI fue la generación de 3-nitrotirosina, como lo muestra el análisis de MS. Además, también se observó la formación de ditirosina. Finalmente, la producción intracelular de •NO2 tras la fotólisis DNI en células endoteliales aórticas bovinas se evidenció mediante la nitración de la sonda análoga de tirosina ácido p-hidroxifenilacético (PHPA) y la nitración de tirosina de proteína celular.

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